甲基化測序（5mC）
DNA甲基化（DNA Methylation）是一種重要的表觀遺傳學修飾，在細胞分化、增殖、衰老等方面具有重要的調控作用。5-甲基胞嘧啶（5mC）是最重要的一種DNA甲基化修飾，廣泛存在于植物、動物等真核生物基因組中，被稱為“第五堿基”
全基因組甲基化（WGBS）
全基因組甲基化測序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）是通過 Bisulfite處理將基因組中未發生甲基化的C堿基進行轉換，用以區分具有甲基化修飾的C堿基，并結合二代高通量測序技術判斷CpG/CHG/CHH位點是否發生甲基化的一種方法。通過WGBS，可實現單堿基分辨率的甲基化位點精準、高效定位。
PacBio人全基因組甲基化
PacBio長讀長測序可直接對DNA分子進行測序而不進行擴增，無需亞硫酸氫鹽處理或其他特殊的文庫構建方法，即可從單個文庫中獲得高度準確的堿基（熒光）和甲基化（動力學）信息。堿基序列信息和甲基化信息同時獲取，一份數據即可同時用于SNP、InDel、SV、CNV、甲基化、基因組組裝等研究應用，并可識別單倍型層面等位基因特異性甲基化。
應用方向
【醫學領域】
- 表觀遺傳學：研究不同細胞類型、組織或發育階段之間的DNA甲基化差異，幫助揭示表觀遺傳變化在生物學過程中的作用；
- 個體差異和種群遺傳學：研究個體之間的DNA甲基化差異，有助于解析甲基化的遺傳基礎，以及它如何影響個體的健康和易感性；
- 疾病發生機制：比較正常和疾病狀態下的DNA甲基化模式，挖掘與疾病發生和進展相關的甲基化變化，增進對疾病發生和發展過程的理解；
- 環境影響研究：外部環境因素（如營養、毒素、藥物等）可以影響DNA甲基化，了解環境因素如何通過甲基化改變基因表達，從而影響個體的生理和疾病風險；
【農學領域】
- 植物生長調控：研究不同生長階段或不同環境條件下植物組織的甲基化狀態，揭示DNA甲基化對基因表達的影響，進而了解其在植物生長發育中的作用機制；
- 環境適應機制：研究植物在面對干旱、鹽堿、病蟲害等逆境時的甲基化模式變化，識別與抗逆相關的甲基化標記，從而為培育具有更強抗逆性的作物品種提供策略；
- 品質形成和改良：分析影響農產品品質的基因甲基化情況，如糖分、蛋白質含量、色澤等，探索如何通過甲基化修飾來優化作物的營養成分和口感；
- 進化研究：比較不同物種之間的DNA甲基化模式，揭示甲基化在進化中的角色，有助于理解甲基化在物種適應和多樣性產生中的貢獻；
案例解析
HiFi測序發現WGBS數據無法實現分型所以無法解釋hyper-mCpG事件
PacBio HiFi甲基化分析助力罕見病診斷
甲基化可調節基因的表達和關閉，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關，是表觀遺傳學的重要研究內容之一。本研究選取152個家族的276個罕見病樣本生成HiFi數據集，以識別基因組中罕見的（~0.5%）多個甲基化CpG富集（hyper-mCpG）的事件。研究比較了WGBS（N = 1184）和HiFi-GS（N = 276）測得的CpG島數據中共有的93個樣本的相關性，顯示兩種方法之間有顯著一致性，相關性為0.90。共識別出25,543個罕見的hyper-mCpG，其中81%是等位基因特異性的，并預計可能會導致調控元件的失活。每位患者平均有30～40個hyper-mCpG與罕見病基因重疊，基于hyper-mCpG的分析解析了更多罕見病關鍵基因中先前被忽視的基因中的重復擴增事件，使得更多的罕見病病例得以解釋。研究表明，HiFi測序可直接檢測罕見病患者基因組上的串聯重復和甲基化，還進一步實現分型，有助于精準分析致病原因。
參考文獻：Cheung WA, Johnson AF, Rowell WJ, et al. Direct haplotype-resolved 5-base HiFi sequencing for genome-wide profiling of hypermethylation outliers in a rare disease cohort. Nature Communications, 2023, 14(1): 3090.
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